原代組織細(xì)胞的解離步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：1160 更新時(shí)間：2021-08-12
原代組織細(xì)胞的解離從原代組織上獲取單個(gè)細(xì)胞懸液的常用方法是利用酶的解聚作用。盡量縮短用酶處理細(xì)胞的時(shí)間，以獲得高的存活率。按下面的方法解聚整個(gè)組織，以獲得大量細(xì)胞。
胰酶
1.先去除無關(guān)組織，然后用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。通過在不含鈣鎂的平衡鹽溶液進(jìn)行重懸來清洗組織碎塊。待組織碎塊沉降后去掉上清液。重復(fù)清洗2-3次。
2.將裝有組織碎塊的容器置于冰上，去掉所有上清液。在不含鈣鎂的平衡鹽溶液中加入0.25%胰酶(每100mg組織大約需要1ml 胰酶)。
3.在4℃ 下孵育6-18小時(shí)，使低活性的胰酶盡量滲入組織。
4.緩慢倒掉胰酶。在37℃ 下將殘余的胰酶與組織碎塊共同孵育20-30分鐘。
5.向組織碎塊加入溫?zé)岬?培養(yǎng)基，并輕輕地吹吸以分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基。還應(yīng)加入大豆胰酶抑制劑。
6. 用滅菌的不銹鋼網(wǎng)(100-200μm)過濾細(xì)胞懸浮液，直至所有組織*散開。計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
膠原酶
1.用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)將組織碎塊清洗數(shù)次。
2.加入膠原酶(50-200單位/ml膠原酶HBSS)。
3.在37℃ 下孵育4-18小時(shí)。加入3mM CaCl2 可以提高解離效率。
4.用滅菌的不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液，將離散的細(xì)胞和組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進(jìn)一步解離，可向組織片段中加入新鮮的膠原酶。
5.通過離心HBSS清洗細(xì)胞懸浮液數(shù)次。
6.用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
分散酶
1.用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液清洗組織碎塊數(shù)次。
2.加入分散酶(0.6-2.4單位/ml分散酶不含鈣鎂的平衡鹽溶液)。
3.在37℃下孵育20分鐘至數(shù)小時(shí)。
4.用滅菌的不銹鋼網(wǎng)或尼友網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液，將離散的細(xì)胞和組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進(jìn)一步解離，可向組織片段中加入新鮮分散酶。
5.通過離心平衡鹽溶液清洗細(xì)胞懸浮液數(shù)次。
6.用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
