用ELISA法可檢測幽門螺桿菌的抗體

    1 材料和方法

    1.1 材料

    ①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：②酶聯(lián)板離心籃：根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實驗室自行設(shè)計制成。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測儀：④試劑：過氧化物酶（HRP），R2=3.2，美國Sigma公司產(chǎn)品。鄰苯二胺（OPD）：按文獻配制。包被液：取碳酸鈉1.59g加碳酸氫鈉2.93g，蒸餾水1000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇（PEG）。封板液：5%小牛血清。戊二醛固定液：25%戊二醛液，100ml裝，Kochligh進口分裝，用時稀釋成0.25%戊二醛固定液。終止液：2NH2SO4。⑤抗原的制備：將澳大利亞*佩思醫(yī)院的Hp標準菌株（NCTC11638）及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板，37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學(xué)鑒定（自制兔抗Hp抗體），然后取單個菌落移種于另一血平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d，經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng)，3d后將菌苔刮下，置生理鹽水中制成菌液，加福爾馬林固定（0.1%～0.3%），4℃過夜，3000r/nin離心30min，沉淀3次，將zui后1次沉淀懸于少量PBS液內(nèi)，用比濁管沒出細菌濃度，制成含菌3×109ml，置冰箱冰凍，反復(fù)凍融3次，經(jīng)顯微鏡檢查無菌體存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，-20℃保存?zhèn)溆谩＂夼R床血清標本：采自胃鏡檢查患者，隨機采取1988年8～10月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存-20℃?zhèn)溆谩＂哧幮詫φ昭?，進行ELISA測定，取其平均OD值作對照。⑧酶標羊抗人IgG結(jié)合物（SAHIgG—HRP）的制備：按過碘酸鹽改良法，略加改進標記制成酶標抗體。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續(xù)攪拌5min，對pH4.2，0.001mol/L醋酸鹽緩沖液（用2molHC1調(diào)pH）透析過夜，中間換水4次，加羊抗人IgG14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸鹽緩沖液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化鈉（4mg/ml）0.2ml，置4℃2h，對pH7.2，0.01molPB-0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內(nèi)結(jié)合物，以50%飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后，測定精制結(jié)合物，E/P克分子比值合格后，將結(jié)合物小瓶分裝置-20℃保存，備用。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻進行。

    1.2 方法

    并稍加改進，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×108億/ml（含蛋白8.6μg）稀釋后，每孔加100μ，離心籃離心20min2000r/min后，倒去孔內(nèi)液體，然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗滌液洗3次（每次3min），加5%小牛血清液，200ml/孔，經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內(nèi)液體。每孔加待檢血清（1：100稀釋）100ml，37℃保溫1h后，如上洗滌3次，同時做陰性對照孔和空白孔。之后于各孔內(nèi)加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結(jié)合物100ml，37℃保溫半小時，于各孔中加入2NH2SO450μl終止反應(yīng)后，于酶聯(lián)測定儀以波長490nm測定OD值，將測得標本OD值（P）與陰性對照OD值（N）比（P/N），若P/N比大于或等于2.0為陽性。