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Western Blot蛋白質磷酸化操作小貼士
點擊次數:468 更新時間:2022-02-22

 WB 是檢測和定量磷酸化蛋白質的重要實驗方法,然而大家一直都說磷酸化蛋白 WB 不好做!WB 磷酸化蛋白曝不出條帶的時候,會特別沮喪。

遠慕在此給大家列出幾點小建議,希望能幫助您改善一下實驗結果。

 

 

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1、樣本是否表達:
查閱資料或通過預實驗確定。

2、對照設置:
陽性和陰性對照。
總蛋白抗體對照,對于特定時間的特定樣品,磷酸化和非磷酸化蛋白質的總和代表該特定蛋白質的總量。在相同的 WB 檢測中, 磷酸化蛋白質的量增加通常伴隨著非磷酸化蛋白質的降低。

3、內參設置:
根據實驗選擇合適的內參,如Actin、GAPDH 等

4、適當的提取方法:
蛋白質提取的方法不僅影響提取效率,還會影響蛋白的質量。建議采用裂解液裂解和超聲破碎組合的方式,可確保整個樣本充分裂解。

5、低溫操作:
室溫條件下,磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。請勿反復凍融,操作時一定置于冰上。

6、加入抑制劑:
組織或細胞裂解時會釋放出大量內源性蛋白磷酸酶,它會導致磷酸化蛋白的去磷酸化,因此,必須在裂解液中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑。

7、最重要的一點:
檢測時選擇近紅外熒光標記抗體,一次可檢測多個蛋白,無需多次曝片,方便檢測。一般磷酸化和總蛋白的條帶位置十分接近,傳統(tǒng)方式不易區(qū)分。

這樣大家在用WB檢測磷酸化水平時,是不是就方便多了,不用像傳統(tǒng)方法那樣,在壓完磷酸化抗體后,將膜 strip 后再壓總蛋白抗體;也不需要同時跑兩塊膠分別檢測。

使用近紅外熒光標記抗體(二抗),孵育后直接放入儀器,一鍵成像,簡單快速!

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