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蛋白質(zhì)怎么在制備過程中保持蛋白活性?
點(diǎn)擊次數(shù):452 更新時間:2022-12-16

蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識很廣。高分子蛋白質(zhì)具有一定的立體構(gòu)象,相當(dāng)不穩(wěn)定,極易變性、變構(gòu),為得到天然狀態(tài)的蛋白質(zhì),盡量采用溫和的手段,如中性、低溫、避免起泡等,還要注意防腐。

試劑盒2.jpg

動物材料中的蛋白質(zhì)有些可溶的形式存在于體液(如血漿、消化硫等)中,可以不必經(jīng)過提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì),只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物,如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì),最后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后,用水、xi鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑,將蛋白質(zhì)溶解出來,再用離心法除去不溶物,即得粗提取液。

整個制備過程一般可分為5 個階段:①材料的選擇和預(yù)處理,②細(xì)胞的破碎(有時需進(jìn)行細(xì)胞器的分離),③提取,④純化(包括鹽析,有機(jī)溶劑沉淀,有機(jī)溶劑提取、吸附、層析、超離心及結(jié)晶等),⑤濃縮、干燥及保存。以上5 個階段不是要求每個方案都完整地具備,也不是每一階段截然分開。

不論是哪一階段使用哪一種方法,均必須在操作中保持生物大分子結(jié)構(gòu)的完整性。保存活性,防止變性及降解現(xiàn)象的發(fā)生。因空間結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在,遇酸、遇堿、高溫、劇烈的機(jī)械作用及強(qiáng)烈的輻射等均可導(dǎo)致活性喪失。

細(xì)胞破碎方法有多種,比如機(jī)械法(如組織搗碎勻漿機(jī)、玻璃勻漿器)、物理法(反復(fù)凍融法、冷熱交替法、超聲波法、高壓破碎),化學(xué)及生物化學(xué)法(加入有機(jī)溶劑、溶解酶或裂解酶、表面活性劑)等。

高壓細(xì)胞破碎法是一種物理破碎方法,避免了化學(xué)法和酶法等導(dǎo)致的化學(xué)物殘留和污染等問題。超聲破碎法可能出現(xiàn)的起泡現(xiàn)象在高壓破碎時是不會出現(xiàn)的。

樣品經(jīng)適當(dāng)預(yù)處理,再配合使用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀,提取到的蛋白質(zhì)活性好。(參考文獻(xiàn):氯氟氰菊酯對德國小蠊保護(hù)酶活性的影響,中國媒介生物學(xué)及控制雜志,2009,20(4):303-306)。這是因?yàn)樵诩?xì)胞破碎過程中,低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀提供周密的保護(hù),最大限度地保持蛋白質(zhì)活性,具體表現(xiàn)在:

①du創(chuàng)的沖洗系統(tǒng)及進(jìn)口鏡面拋光316L不銹鋼管道,防止樣品殘留,保證管道清潔,排除酸堿干擾。 316L不銹鋼拋光管道316L不銹鋼管道

②進(jìn)樣、破碎、出樣全過程可在4~6℃低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行,避免高溫導(dǎo)致的蛋白質(zhì)失活。

③破碎壓力0~207Mpa連續(xù)可調(diào),便于摸索最佳破碎條件,保證溫和破碎。

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