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蘇木素-伊紅染色法檢測細(xì)胞凋亡實驗步驟
點擊次數(shù):197 更新時間:2024-12-30

蘇木素-伊紅(hematoxylin/eosin)染色法是一種用普通光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的簡便方法。細(xì)胞凋亡時主要的形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞體積變小,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)高度凝集、邊緣化,呈新月狀,隨后染色質(zhì)裂解成大小不等的塊狀,核膜裂解,細(xì)胞以類似胞吐的方式形成凋亡小體。蘇木素容易被氧化,其氧化產(chǎn)物蘇木紅是真正的染料,蘇木紅與鋁結(jié)合形成一種帶正電荷的藍(lán)色色精,呈堿性。帶負(fù)電荷的脫氧核糖核酸根和帶正電荷的藍(lán)色色精進(jìn)行極性吸附而完成細(xì)胞核的染色。伊紅可分為幾種,如伊紅Y和伊紅B等。伊紅Y是一種酸性紅色胞質(zhì)性染料,對細(xì)胞質(zhì)、肌纖維及膠原纖維具有著色性,呈粉紅色。細(xì)胞經(jīng)HE染色后,細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色,根據(jù)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征可觀察細(xì)胞凋亡的情況。


貼壁細(xì)胞的H/E染色

1)對于貼壁生長的細(xì)胞,讓其在蓋玻片上爬行生長。

2)經(jīng)藥物或其他因素處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,取出蓋玻片,用×1 PBS輕輕洗滌,室溫,3分鐘×3次。

3)用4%的多聚甲醛在常溫下固定20分鐘或冷丙酮-20℃固定15分鐘,取出細(xì)胞爬片,室溫晾干,-20℃保存或直接進(jìn)行染色。

4)蒸餾水浸泡細(xì)胞爬片5分鐘。

5)放入蘇木精液染5~7分鐘。

6)流水洗去附著染液,1%鹽酸酒精分化1~2秒。

7)流水沖洗10分鐘藍(lán)化,使切片由淡紅色變?yōu)榛宜{(lán)色。

8)放入伊紅染液中2~5秒。

9)放入95%酒精Ⅰ(2分鐘)→95%酒精Ⅱ(2分鐘)→100%酒精I(xiàn)(2分鐘)→100%酒精I(xiàn)(5分鐘)→二甲苯Ⅰ(2分鐘)→二甲苯Ⅱ(2分鐘)中脫水、透明。

10)中性樹膠封片。

11)在普通光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。


懸浮細(xì)胞的H/E染色

1)對于懸浮生長的細(xì)胞經(jīng)藥物或其他因素處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,置入離心管中,離心(1000rpm,5分鐘),收集細(xì)胞。

2)×1 PBS洗滌細(xì)胞1~2次。

3)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(1~15)×104/ml,涂片或用離心甩片,4%的多聚甲醛在常溫下固定20分鐘或冷丙酮-20℃固定15分鐘,取出細(xì)胞爬片,室溫晾干,-20℃保存或直接進(jìn)行染色。

4)蒸餾水浸泡細(xì)胞爬片5分鐘。

5)接貼壁細(xì)胞H/E染色步驟中的5)-11)。


注意事項

①細(xì)胞核染色淡,原因可能為蘇木素染色時間過短、染液過度氧化失去染色能力或者分化步驟時間過長等;而細(xì)胞核染色過深的原因可能為蘇木素染色時間過長或者分化時間太短。

②細(xì)胞核如果呈紅或棕色,原因可能為蘇木素染液過度氧化或蘇木素染色后水中返藍(lán)不足,可用流水或弱堿性溶液如稀氨水或0.2%NaHCO3,在蘇木精染色后給細(xì)胞足夠的藍(lán)化時間。

③當(dāng)室溫低,不利于染色時,通常可用加熱染液的方法進(jìn)行染色。

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