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植物cDNA合成的原理和操作步驟
點(diǎn)擊次數(shù):100 更新時(shí)間:2025-04-11

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>
掌握植物cDNA合成的原理和方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

反轉(zhuǎn)錄酶主要用于體外cDNA的合成。目前最chang用的反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它們具有依賴于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性,可以以RNA分子為模板,合成出一條DNA鏈。形成的DNA是與RNA模板互補(bǔ)的,因而反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA分子稱之為cDNA。

三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品

植物總RNA溶液。紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、冰盒、口罩、手套、EP管架、超凈工作臺、移液器、DEPC處理過的槍頭、EP管等。5×M-MLV RT Buffer、2.5mM dNTP mix、RNase抑制劑(30U/µL)、M-MLV Reverse Transcriptase、Oligo(dT)18 primer、無菌的DEPC水等。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

注意:戴手套進(jìn)行以下操作,嚴(yán)防RNase污染。

1.在超凈工作臺上吸取1ml無菌水到EP管中,加入2µl植物總RNA溶液,充分混勻,在紫外分光光度計(jì)上測定260,280nm的光吸收值(OD值),然后計(jì)算RNA的濃度,并分析其純度。

分光光度(紫外吸收)法
(1)預(yù)熱紫外分光光度計(jì)10—20分鐘。
(2)取兩只比色杯,一只裝入1ml H2O溶液,作為空白溶液,用來校正分光光度計(jì)零點(diǎn)及調(diào)整透光度至100。
(3)DNA純度及濃度測定:
①取2ul DNA或RNA樣品加入另一比色杯,加dH2O至1000ul,混勻。
②將兩只比色杯置分光度計(jì)中,調(diào)入射光波長,分別用空白溶液調(diào)整零點(diǎn)(T為100,OD為0),測定待測樣品液在260nm、280nm、230nm的OD值。
③計(jì)算濃度:對于雙鏈DNA 1.0 OD260=50ug/ml,
對單鏈RNA1.0 OD260=40ug/ml。
④測定純度:v純的RNA溶液其OD260/OD280的比值應(yīng)介于1.7至2.0,OD260/OD230的比值應(yīng)大于2.0。?RNA樣品OD260/OD280的比值太小,說明有蛋白或苯ben酚污染。比值大于2.0,則可能被異硫氰酸胍污染。?OD260/OD230的比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。
純的DNA溶液其OD260/OD280應(yīng)為1.8,OD260/OD230應(yīng)大于2.0。
?OD260/OD280大于1.9時(shí),表明有RNA污染,小于1.6時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染。
?OD260/OD230小于2.0時(shí),表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì),如核苷酸、氨基酸、酚等。

2.在DEPC處理過的Ep管中加入約4µg總RNA和1µl 0.5µg/µl的Oligo(dT)18 primer,小心混勻,70℃保溫5分鐘,立即浸入冰水中。

3.按次序分別加入下列試劑:
5µl 5×M-MLV RT Buffer
2µl dNTP mix(2.5mM)
1µl RNase抑制劑(30U/µL)
1µl M-MLV Reverse Transcriptase
然后加DEPC水到25µl.

4.小心混勻,室溫離心5秒,將所有溶液收集到管底,37℃保溫1小時(shí)。

5.90℃處理5分鐘,冰上冷卻。

6.用于PCR擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆?

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